DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE

3.7 Atividade da PspA4Pro após a purificação. A atividade da PspA4Pro foi verificada por teste de ligação à lactoferrina humana (Sigma-. Aldrich). As proteínas ...

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA A DE SUPERFÍCIE DO PNEUMOCOCO DO CLADO 4 (PspA4pro) D. B. FIGUEIREDO1, E. CARVALHO1, S. KRASCHOWETZ1, R. T. ZANARDO1, G.G. SILVA2, G. CAMPANI2, T. C. ZANGIROLAMI2, J. CABRERA-CRESPO1, V. M. GONÇALVES1 1

Instituto Butantan, Centro de Biotecnologia, 2Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Engenharia Química E-mail para contato: [email protected]

RESUMO: S. pneumoniae provoca doenças com elevada mortalidade infantil como pneumonia, meningite e sepse, assim buscam-se vacinas alternativas mais eficazes. Neste trabalho desenvolveu-se um processo escalonável de purificação do fragmento recombinante da PspA do clado 4 para uso em uma nova vacina, que consistiu das etapas: ruptura celular em homogeneizador contínuo de alta pressão, precipitação com detergente CTAB, clarificação, cromatografia de troca aniônica, crioprecipitação a pH4,0 e cromatografia de troca catiônica. PspA4Pro foi obtida com pureza >97% e recuperação de 30%. A eliminação final do lipopolissacarídeo (contaminante que causa febre) foi feita em resina de polilisina. Espectros de dicroísmo circular mostraram estrutura secundária correta da PspA4Pro purificada, bem como estabilidade térmica e a variações de pH. A atividade de PspA4Pro foi confirmada em ensaio de ligação à lactoferrina. Portanto, o processo é adequado à obtenção de PspA4Pro com as características requeridas para uso humano.

1. INTRODUÇÃO Dentre os antígenos proteicos candidatos ao uso em vacinas pneumocócicas, a proteína A de superfície do pneumococo (PspA) tem se mostrado bastante promissora, principalmente por ser uma proteína exposta externamente à capsula polissacarídica. A estrutura da PspA é composta por quatro domínios. A porção N-terminal é bastante carregada eletricamente e apresenta estrutura secundária predominantemente do tipo α-hélice “coiled-coil”. Esta porção se projeta para fora da superfície do microrganismo e nela encontra-se a região definidora de clado . Em seguida há um domínio flexível rico em prolinas. A ele segue-se um domínio com 10 repetições de uma sequência de 20 aminoácidos, responsável pela ligação à colina, ancorando a proteína aos resíduos de colina encontrados nos ácidos teicóico e lipoteicóico da parede celular . A porção Cterminal é composta por uma cauda hidrofóbica (Briles, et al., 1997). Com base na homologia e no alinhamento das sequências de aminoácidos de PspA de diferentes cepas de S. pneumoniae, foram observadas 3 famílias distintas desta proteína, as quais podem ser divididas em 6 grupos, denominados clados. A família 1 da PspA é constituída por dois clados: 1 e 2, a família 2, por três clados: 3, 4 e 5 e a família 3, por apenas um clado: 6 (Bogaert et al. , 2003). As famílias 1 e 2, em especial os clados 1 a 4, são predominantes no

Área temática: Processos Biotecnológicos

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mundo todo e no Brasil estão presentes em 99% dos isolados clínicos (Mantese et al. , 2003). Uma vez que proteínas dentro de uma mesma família apresentam reação imunológica cruzada, acredita-se que apenas duas proteínas, uma da família 1 e outra da família 2, seriam suficientes para compor uma vacina com boa cobertura das cepas de pneumococo circulantes na população .

2. OBJETIVOS Desenvolver um processo de purificação para obter a proteína PspA4Pro, produzida por cultivo de E. coli recombinante, com pureza superior a 95% com relação às demais proteínas, para uso em vacinas pneumocócicas tanto de proteínas puras como conjugadas a polissacarídeos.

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Material de partida Devido às características antigênicas, o fragmento de PspA do clado 4 clonado contém a porção N-terminal, a região definidora de clado e a primeira parte da região rica em prolina da molécula (PspA4Pro) e foi desenvolvido pela equipe da Dra. Eliane N. Miyiaji, que gentilmente cedeu a cepa de E. coli transformada para a realização deste trabalho (Moreno, et al. , 2010) A proteína foi produzida na forma solúvel em E. coli
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